実験指南所

現在、牛の下垂体を用いて、ホルモン分泌細胞の細胞膜を分離し、あるレセプターの 結合試験を行おうとしています。 あまり経験がないのですが、どの様にすれば上手くできるか御指導下さい。

入手は、食肉市場の解体場です。下垂体を譲り受け、ice-cold PBSで冷蔵し、1時間 かけて輸送します。 前葉の分離は、下垂体の硬膜を切り取り、中葉と分離します。中葉との境界も硬い膜 で覆われています。分泌細胞はこの硬い膜に覆われた柔らかいところにあるはずです。

文献に従って、タンパク質分解酵素阻害剤を入れた緩衝液中でホモジナイズし、低速 で結合織等を取り除き、超遠心で膜部分を回収しました。 沈殿をホモジナイズ緩衝液で再懸濁し、-80度フリーザーに保管しました。 再融解すると、膜がアグッて見えました。 しかし、文献によるとあるはずの特異的な受容体結合が確認できませんでした。

質問１ 下垂体は摘出後、速やかに処理しないとだめでしょうか？
質問２ 分泌細胞は柔らかい部分が一番多いのでしょうか？
質問３ 膜分画のみ取れるようにもっと手順を踏むべきでしょうか。
質問4 沈殿で保管した方がいいでしょうか 液体窒素保管がいいでしょうか
質問5 アグッてしまわない凍結保管があるのでしょうか？